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Une nouvelle méthode d’amélioration de souche microbienne basée sur l’hétérogénéité entre cellules

Mis à jour le 19/02/2019
Publié le 19/02/2019
Mots-clés : MICA - BIORES-1 - OPENINRA-3

Prendre en compte la variabilité d'expression des gènes et non la moyenne

Les conditions de culture hautement stressantes liées aux productions industrielles représentent un frein aux performances métaboliques des microorganismes utilisés dans les procédés biotechnologiques. Nous avons développé une stratégie innovante d’amélioration de souche microbienne basée sur la cytométrie en flux. Elle a permis d’obtenir chez la levure Saccharomyces cerevisiae un promoteur variant du gène GRX1 induisant une expression plus variable de cellule à cellule qui confère une résistance accrue au stress oxydatif.

  • Contexte et enjeux

Pour obtenir des souches de microorganismes industriels aux propriétés de résistance au stress améliorées, des stratégies « d’ingénierie évolutionnaire » (evolutionary engineering) ou encore d’ingénierie du contrôle génétique à travers la modification de promoteurs de gènes d’intérêt peuvent être développées 1-4. L’approche proposée est différente et originale car il s’agit de moduler la variabilité d’expression (phénomène appelé « bruit » qui produit une hétérogénéité d’expression de cellule à cellule) de gènes clés de manière ciblée. En effet, des variants génétiques de promoteurs peuvent engendrer des niveaux de variabilité d’expression très différents par rapport au promoteur natif, parfois avec une moyenne similaire, permettant ainsi de limiter l’impact sur les autres propriétés des souches (modifications ciblées et maîtrisées, pas de surexpression ou de sous-expression constitutive de gènes). Les conséquences phénotypiques attendues de ce remplacement du promoteur d’origine par une version mutante conférant plus d’hétérogénéité d’expression entre cellules sont une résistance accrue de la souche vis-à-vis des stress relatifs au gène étudié 5-7, donc une plus grande robustesse et stabilité de la souche. L’objectif de cette étude était donc de développer une nouvelle approche d’évolution de souches par une stratégie innovante basée sur la cytométrie de flux. Nous avons focalisé notre étude sur le gène de résistance au stress oxydatif GRX1 chez Saccharomyces cerevisiae.

  • Résultats

Après avoir généré et étudié une banque de mutants du promoteur du gène GRX1, nous nous sommes focalisés sur le clone qui possédait le variant de promoteur produisant la variabilité d’expression de GRX1 la plus forte à moyenne équivalente par rapport au promoteur d’origine. Cette souche à la variabilité d’expression de GRX1 augmentée a montré une résistance fortement accrue au péroxyde d’hydrogène (H2O2) et à l’hydropéroxyde de cumène par rapport à la souche sauvage (Figure 1)

Figure 1 : Croissance résiduelle de souches de levures possédant soit le promoteur natif de GRX1, soit le variant identifié dans cette étude, dans des milieux de culture possédant soit du péroxyde d’hydrogène H2O2 (A) ou de l’hydropéroxyde de cumène (B). La croissance résiduelle correspond à la croissance mesurée par densité optique après 30h dans un milieu de culture non-sélectif divisée par la croissance après 30h dans un milieu contenant l’agent stressant.. © Inra, J. Liu
Figure 1 : Croissance résiduelle de souches de levures possédant soit le promoteur natif de GRX1, soit le variant identifié dans cette étude, dans des milieux de culture possédant soit du péroxyde d’hydrogène H2O2 (A) ou de l’hydropéroxyde de cumène (B). La croissance résiduelle correspond à la croissance mesurée par densité optique après 30h dans un milieu de culture non-sélectif divisée par la croissance après 30h dans un milieu contenant l’agent stressant. © Inra, J. Liu

  • Perspectives

Cette stratégie est novatrice dans la mesure où elle se propose d’utiliser le niveau de variabilité d’expression des gènes (et non la moyenne d’expression) comme paramètre expérimental à optimiser dans le cadre d’une amélioration de souche. Elle est applicable à tout type de stress, et à tout micro-organisme et gène compatibles avec la cytométrie. La contrepartie est d’avoir identifié au préalable le (les) gène(s) cible et bien sûr le stress à améliorer. La partie non-protégée de ce travail est publiée dans Frontiers in Microbiology 8 (lire l'article).

  • Valorisation

La stratégie fait l’objet du savoir-faire secret détenu par INRA Transfert (enregistrement de l’invention sous le numéro et le nom DI-RV-17-0115 « Méthode d’évolution ciblée de microorganismes – Method for targeted evolution of microorganisms = MicrobEvol ») et Toulouse White Biotechnology qui a financé ce projet.

  • Références bibliographiques

1 Blazeck, J. & Alper, H. S. Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level. Biotechnol J 8, 46-58, doi:10.1002/biot.201200120 (2013).
2 Rajkumar, A. S. et al. Engineering of synthetic, stress-responsive yeast promoters. Nucleic Acids Res 44, e136, doi:10.1093/nar/gkw553 (2016).
3 Winkler, J. D. & Kao, K. C. Recent advances in the evolutionary engineering of industrial biocatalysts. Genomics 104, 406-411, doi:10.1016/j.ygeno.2014.09.006 (2014).
4 Steensels, J. et al. Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity. FEMS Microbiol Rev 38, 947-995, doi:10.1111/1574-6976.12073 (2014).
5 Blake, W. J. et al. Phenotypic consequences of promoter-mediated transcriptional noise. Mol Cell 24, 853-865, doi:10.1016/j.molcel.2006.11.003 (2006).
6 Liu, J. et al. Natural yeast promoter variants reveal epistasis in the generation of transcriptional-mediated noise and its potential benefit in stressful conditions. Genome Biol Evol 7, 969-984, doi:10.1093/gbe/evv047 (2015).
7 Liu, J., Francois, J. M. & Capp, J. P. Use of noise in gene expression as an experimental parameter to test phenotypic effects. Yeast 33, 209-216, doi:10.1002/yea.3152 (2016).
8 Liu, J., Lestrade, D., Arabaciyan, S., Cescut, J., Francois, J. M. & Capp, J. P. A GRX1 promoter variant confers constitutive noisy bimodal expression that increases oxidative stress resistance in yeast, Front Microbiol, 9:2158. doi: 10.3389/fmicb.2018.02158 (2018).

  • Contact

Jean-Pascal Capp, maître de conférences INSA Toulouse, capp@insa-toulouse.fr, UMR LISBP, Département MICA, Centre Occitanie Toulouse