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Nouvelle méthode d’ingénierie du génome chez les micro-algues Phaeodactylum tricornutum

Publié le 18/02/2019
Mots-clés : MICA - BIORES-1

Créer une microalgue "châssis"...

L’ingénierie génétique est devenue incontournable tant pour accumuler des connaissances sur la fonction des gènes, le métabolisme et la physiologie que pour améliorer leur potentiel métabolique des organismes. Les ciseaux moléculaires se sont révélés être des outils extrêmement efficaces pour modifier spécifiquement le génome des microalgues. Cependant, les techniques développées jusqu’alors induisaient une instabilité génétique des souches transformées. Notre équipe a développé une nouvelle méthode d’édition des génomes permettant de modifier simultanément plusieurs gènes et ceci sans introduction d’ADN exogène dans l’organisme. Cette méthode repose sur la délivrance du système CRISPR/Cas9 sous forme ribonucléoprotéique et sur le développement de nouveaux marqueurs de sélection positive.

  • Contexte et enjeux

Face à la raréfaction des ressources fossiles et la volonté de limiter les émissions de gaz à effet de serre, il existe un fort intérêt scientifique, économique et sociétal pour l’utilisation de sources de carbone renouvelables à des fins de production de composés pour les secteurs de la chimie, des matériaux et de l’énergie. Dans ce contexte, la biotechnologie industrielle développe de nouveaux biocatalyseurs capables de répondre à ces défis. De par leur capacité à produire un grand nombre de composés à partir de CO2 et d’énergie solaire, les microalgues apparaissent comme une solution porteuse d’avenir. Cependant les rendre économiquement compétitives nécessite d’optimiser leur performance voire de créer de nouvelles propriétés métaboliques. L’équipe Biologie de Synthèse chez les Microalgues, dirigée par Fayza Daboussi a pour objectif de créer une microalgue « châssis », manipulable génétiquement avec facilité et prédiction et robuste dans les procédés de production à grande échelle. Ce projet capitalise sur les résultats obtenus en 2014 sur d’établissement de la preuve de concept de l’ingénierie génétique ciblée de la diatomée P. tricornutum via l’utilisation de méganucléases et des TALE nucléases et la création de souches contenant un fort contenu lipidique (Daboussi et al. 2014, Nature Communications). En 2016, la preuve de concept de l’ingénierie médiée par CRISPR/Cas9 a été réalisée (Nymark et al. 2016). La simplicité de mise en œuvre et son coût de quelques dizaines d’euros a permis de démocratiser l’utilisation de CRISPR/Cas9 pour modifier le génome chez les microalgues. Cependant, plusieurs limitations telles que l’intégration aléatoire de vecteurs d’expression qui peut inactiver des gènes endogènes ou encore l’exposition chronique des cellules au système CRISPR/Cas9, ont amené l’équipe à développer une nouvelle méthode d’ingénierie des génomes sans introduction d’ADN exogène dans la cellule.

Inactivation simultanée de gènes réalisée par délivrance du système CRISPR/Cas9 sous forme ribonucléoprotéique. © Inra, Fayza Daboussi
Inactivation simultanée de gènes réalisée par délivrance du système CRISPR/Cas9 sous forme ribonucléoprotéique © Inra, Fayza Daboussi

  • Résultats

La méthodologie développée est basée sur la délivrance du ciseau moléculaire CRISPR/Cas9 sous la forme ribonucléoprotéique (RNPs). L’absence de mutant de la paroi et les faibles efficacités de transformation par biolistique rendait quasi impossible l’obtention de mutants sans co-transformation avec un vecteur portant un marqueur de sélection. La stratégie employée par cette équipe est basée sur la délivrance simultanée de plusieurs complexes CRISPR/Cas9 RNPs, un complexe ciblant un gène dont l’inactivation confère une sélection positive (PtAPT ou PtUMPS) et d’autres ciblant un gène d’intérêt (PtAureochrome1A). Plusieurs dizaines de souches mutées dans les gènes PtAPT ou PtUMPS ont été générées et 65-100% d’entre elles présentent des mutations dans le gène PtAureochrome1A. Enfin, la puissance de cette méthodologie a été confirmée en créant des souches dont les trois gènes ont été inactivés simultanément (triple knock-out) et ceci sans avoir introduit de marqueur de sélection ni d’ADN dans les cellules.

Ces résultats représentent une avancée considérable à plusieurs niveaux : (i) l’amélioration de la spécificité des méthodologies d’ingénierie des génomes puisqu’aucun vecteur n’est intégré de manière aléatoire dans le génome ; (ii) la réduction du temps d’exposition des cellules aux nucléases et donc de ce fait la diminution des coupures non spécifiques potentielles ; (iii) l’identification et la validation de deux nouveaux marqueurs de sélection positive, évitant l’utilisation de gènes de résistance à un antibiotique. Ce développement permet d’avoir des procédés de production compatibles avec le cahier des charges de la biotechnologie industrielle et de limiter les risques sanitaires et environnementaux ; (iv) l’établissement de la première preuve de concept de la modification génétique de plusieurs gènes simultanément chez les microalgues. Ce résultat exceptionnel permet aux microalgues de rattraper leur retard par rapport aux autres châssis industriels (levures, bactéries).

  • Perspectives

Cette équipe dispose ainsi d’une nouvelle méthode permettant d’éditer plus efficacement et plus spécifiquement le génome de P. tricornutum, une avancée incontestable pour l’ingénierie métabolique. Les marqueurs sélectionnés sont très conservés entre espèces, ce qui permettrait d’appliquer cette stratégie à d'autres organismes d'intérêt biotechnologique difficilement transformable.

  • Valorisation, références bibliographiques

1) One-step generation of multiple gene knock-outs in the diatom Phaeodactylum tricornutum by DNA-free genome editing. Manuel Serif, Gwendoline Dubois, Anne Laure Finoux, Marie-Ange Teste, Denis Jallet, and Fayza Daboussi*. (2018). Nature Communications. DOI: 10.1038/s41467-018-06378-9

2) A CRISPR/Cas9 system adapted for gene editing in marine algae. M. Nymark, A. K. Sharma, T. Sparstad, A. M. Bones, et P. Winge, Sci Rep, vol. 6, p. 24951, 25 2016.

3) Genome engineering empowers the diatom Phaeodactylum tricornutum for biotechnology. Daboussi, F, Leduc, Maréchal, Dubois, Guyot, Perez-Michaut, Amato, A., Falciatore, A., Juillerat, Beurdeley, Voytas, D. F., Cavarec, Duchateau, P. (2014). Nature Communications, 5, 7 p. DOI : 10.1038/ncomms4831

  • Contact

Fayza Daboussi (fayza.daboussi@insa-toulouse.fr) UMR LISBP (INRA, Université de Toulouse, INSA, UPS, INP,) , LISBP, 135 Avenue de Rangueil, Toulouse F-31077, France e-mail:  :