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Compréhension du métabolisme azoté et des arômes en fermentation œnologique

Publié le 09/01/2018

 Ce travail ouvre la voie au développement d’un modèle descriptif et prédictif de la production des arômes fermentaires

Une méthode d’analyse quantitative du métabolisme, basée sur la réconciliation de bilans massiques et isotopiques d’une série d’expériences de traçage isotopique a été développée pour comprendre comment les levures gèrent une ressource d’azote multiple. Cette approche a apporté un éclairage original d’une part sur le devenir intracellulaire de chaque source d’azote en fermentation œnologique, et d’autre part, sur l’origine métabolique des acides aminés protéinogéniques et des arômes fermentaires.

  • Contexte et enjeux

En fermentation œnologique, la nutrition azotée des levures (principalement, Saccharomyces cerevisiae) est un élément déterminant qui influence à la fois le déroulement du procédé, en jouant notamment sur la croissance cellulaire, et la qualité sensorielle des vins, en modulant l’activité des voies métaboliques impliquées dans la formation de composés volatils (ou arômes). Certains acides aminés peuvent en effet être des précurseurs d’arômes fermentaires, comme par exemple la leucine, dont le catabolisme peut conduire à la formation d’isoamyl alcool. Dans les moûts de raisin, la ressource azotée se compose d’un mélange complexe d’ammonium et d’acides aminés. A ce jour, il n’existe que peu d’information quantitative sur la façon dont la levure gère cette ressource complexe, bien que cette donnée soit nécessaire à la définition de stratégies pour mieux contrôler le procédé fermentaire ou orienter le profil des arômes fermentaires des vins.
Les nutriments prélevés dans l’environnement sont distribués au travers des réseaux métaboliques des microorganismes pour produire les précurseurs biosynthétiques. De ce fait, la topologie de ces réseaux métaboliques a été largement décrite, notamment pour la levure S. cerevisiae. Des méthodologies d’analyse globale et quantitative du fonctionnement du métabolisme ont également été développées. Elles reposent sur l’interprétation à l’aide de modèles métaboliques, de données expérimentales issues de bilans molaires de conversion et d’expériences de traçage isotopique. Ces approches ont été largement utilisées pour élucider le fonctionnement des réseaux métaboliques impliqués dans l’assimilation de substrats carbonés ou de sources uniques d’azote. Toutefois, du fait de fortes contraintes, notamment analytiques, ces méthodes ne sont pas adaptées à l’étude du métabolisme dans le cas de substrats multiples, comme la ressource azotée des moûts de raisin.

Dans ce contexte, les enjeux principaux de ce projet étaient :
- de développer une approche permettant d’analyser de façon quantitative le métabolisme d’une ressource nutritive complexe (mélange de substrats) 
- de comprendre comment les levures gèrent et utilisent, pendant la fermentation œnologique, la ressource azotée apportée dans le moût de raisin sous forme d’un mélange complexe d’ammonium et d’acides aminés
- de déterminer dans quelle mesure le catabolisme des acides aminés intervient dans la production d’arômes fermentaires (alcools supérieurs, acides ramifiés et esters d’acétate). 
Ce type d’information présente un intérêt majeur dans un contexte œnologique, puisque ces composés participent à la qualité sensorielle des produits et qu’un enjeu majeur de la filière est de pouvoir orienter et contrôler le profil gustatif des vins.

  • Résultats

La démarche d’analyse quantitative et globale du métabolisme d’une source d’azote multiple (figure 1) repose sur la réconciliation de données expérimentales obtenues au cours d’une série d’expériences de traçage isotopique, menées dans des conditions de culture rigoureusement identiques ; pour chaque fermentation, un seul composé de la ressource azotée est marqué, soit sur l’azote, soit sur le carbone. La combinaison des bilans massiques et isotopiques établis pour chaque expérience permet de dresser une image quantitative de la contribution de chaque source azotée au métabolisme de la levure.

 
Figure 1 Représentation schématique de la démarche d'analyse quantitative du métabolisme. © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem
Figure 1 Représentation schématique de la démarche d'analyse quantitative du métabolisme © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem
Figure 1 Représentation schématique de la démarche d'analyse quantitative du métabolisme © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem Figure 1 : Représentation schématique de la démarche d’analyse quantitative du métabolisme.

Dans un premier temps nous avons analysé le devenir intracellulaire de chaque source d’azote consommée par les levures, et en particulier les contributions respectives de l’incorporation directe de ces molécules dans les protéines et de leur catabolisme, dans des conditions de fermentation œnologique ‘standard’ (240 g/L de sucre, 200 mg /L d’azote). Contrairement à ce qui est généralement admis dans la littérature, il est apparu qu’en général, la part des acides aminés directement utilisée dans les réactions de biosynthèse restait limitée, malgré des besoins anaboliques généralement supérieurs aux quantités consommées. Cela se traduit par une forte activité du catabolisme de ces acides aminés, qui fournit à la cellule l’azote nécessaire à une production d’acides aminés protéinogéniques adaptée aux besoins biosynthétiques. En marge de ce comportement général, la démarche d’analyse quantitative du métabolisme mise en place a permis de mettre en évidence un comportement spécifique de la levure vis-à-vis de certains acides aminés. Ainsi, l’arginine, la lysine, l’histidine et la proline sont préférentiellement incorporés directement dans les protéines. Il s’agit des rares acides aminés qui ne peuvent être utilisés par la levure comme seule source d’azote du fait de la faible efficacité des voies métaboliques impliquées dans leur catabolisme.

Un autre volet pouvant être exploré grâce à l’approche que nous avons développée concerne l’origine métabolique du squelette carboné des acides aminés protéinogéniques et des arômes fermentaires pouvant être formés à partir du catabolisme des acides aminés (alcools supérieurs et leurs dérivés esters d’acétate).

Des cartes métaboliques, résumant la répartition quantitative des flux au travers des voies métaboliques peuvent être établies (Figure 2). Nous avons ainsi montré que les acides aminés protéinogeniques provenaient pour plus de 80 % de la synthèse de novo, à partir de précurseurs α-céto acides issus du métabolisme carboné central (sucres). En lien avec cette observation, le catabolisme des acides aminés consommés par la levure ne participe que de façon très limitée (moins de 5 %) à la formation de composés volatils (arômes).

 
Figure 2 : Représentation schématique du devenir de la valine (bleu) et de la leucine (vert) lors de la fermentation œnologique. La contribution du métabolisme carboné central (orange). © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem
Figure 2 : Représentation schématique du devenir de la valine (bleu) et de la leucine (vert) lors de la fermentation œnologique. La contribution du métabolisme carboné central (orange) © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem
Figure 2 : Représentation schématique du devenir de la valine (bleu) et de la leucine (vert) lors de la fermentation œnologique. La contribution du métabolisme carboné central (orange) © Inra, Carole Camarasa, Audrey Bloem Figure 2 : Représentation schématique du devenir de la valine (bleu) et de la leucine (vert) lors de la fermentation œnologique. L’origine métabolique des alcools supérieurs est également représentée, notamment la contribution du métabolisme carboné central (orange).

Enfin, nous avons voulu comprendre comment cette répartition des flux était modulée par des paramètres environnementaux, notamment la disponibilité en azote et en lipides. Ainsi, nous avons montré que la part du catabolisme des acides aminés, le niveau de formation des précurseurs α-cétoacides par le métabolisme carboné central et la distribution des flux autour de ces intermédiaires varient avec la teneur en azote du milieu. Ces connaissances ont permis d’expliquer l’optimum de production des alcools supérieurs, qui se produit pour une concentration intermédiaire en azote du milieu. Les variations dans la disponibilité en azote du milieu modulent l’état d’oxydo-réduction des cellules et en conséquence, affectent de façon différente la formation des alcools supérieurs et celle de leurs acides correspondant. Enfin, cette approche a établi que la teneur en phytostérols (lipides) du milieu modifie la disponibilité intracellulaire en acetyl-CoA, et module ainsi, de façon indirecte, la formation de certains arômes. Par exemple, la proportion relative entre l’isobutanol et l’isoamyl alcool, qui dérivent de la même voie métabolique, varie en fonction de la teneur en phytostérols. Cela peut être expliquée par une régulation par le niveau intracellulaire en acetyl-CoA de la conversion entre les deux α-cétoacides de la voie : l’ α-cétoisovalérate et l’ α-cétoisocaproate.

  • Perspectives

Un enjeu important est de prédire la production des composés volatils en fermentation œnologique afin de pouvoir définir, à plus long terme, des stratégies permettant de la moduler. Cela reste une tâche complexe mais la combinaison des connaissances sur le fonctionnement du métabolisme azoté et des arômes générées dans ce projet, et de données sur les dynamiques de production de ces molécules, ouvre la voie au développement d’un modèle descriptif et prédictif de la production des arômes fermentaires (collaboration Jean-Roch Mouret). D’autre part, la démarche d’analyse quantitative du métabolisme que nous avons développée va pouvoir être appliquée à la caractérisation des levures non-Saccharomyces. En effet, le métabolisme de ces levures, de plus en plus utilisées en fermentation œnologique pour leurs particularités phénotypiques, notamment en termes de production d’arômes, reste encore méconnu. En conséquence, afin d’exploiter au mieux les potentialités de ces espèces dans l’industrie alimentaire, il est important de mieux connaître leur physiologie.

  • Valorisation

Ce travail a été publié sous forme de deux articles dans des revues scientifiques (Applied and Environmental Microbiology ; Microbial Biotechnology) en 2017. Ces articles ont été sélectionnés pour être mis à l’honneur et valorisés sous forme d’un communiqué de presse de l’ASM (American Society for Microbiology) et d’un éditorial de Microbial Biotechnology.
La méthodologie d’analyse quantitative du métabolisme que nous avons développée fait l’objet d’une publication-vidéo dans la revue scientifique à comité de lecture Journal of Visualized Experiments. Ce projet a également ouvert le champ à : i) de nouvelles collaborations, notamment avec l’Institut of Wine Biotechnology (IWBT) de Stellenbosch (Afrique du Sud), l’Institut of Agrochemistry and Food Technology (IATA) de Valencia (Espagne) et la participation à deux projets européens débutant en 2018 (EJD YeastDoc et ITN Aromagenesis), ii) un partenariat industriel (Lallemand, Pernod-Ricard).

  • Références bibliographiques :

Crépin, L., Truong, N. M., Bloem, A., Sanchez, I., Dequin, S., Camarasa, C. (2017). Management of multiple nitrogen sources during wine fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 85 (4), 21. DOI : 10.1128/aem.02617-16.

Rollero, S., Mouret, J.-R., Bloem, A., Sanchez, I., Ortiz-Julien, A., Sablayrolles, J.-M., Dequin, S., Camarasa, C. (2017). Quantitative 13 C-isotope labelling-based analysis to elucidate the influence of environmental parameters on the production of fermentative aromas during wine fermentation. Microbial Biotechnology. DOI : 10.1111/1751-7915.12749.

Gonzalez, R., Morales, P. (2017) Wine secondary aroma: understanding yeast production of higher alcohols. Microbial Biotechnology. DOI: 10.1111/1751-7915.12770.

  • pour en savoir plus :

https://www.asm.org/index.php/newsroom/item/5740-new-research-on-wine-fermentation-could-lead-to-better-bouquet

https://www.jove.com/video/56393/workflow-based-on-combination-isotopic-tracer-experiments-to